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单细胞测序文献精读头颈部肿瘤原发性和转移

2021-4-17 来源：不详浏览次数：次

Single-CellTranscriptomicAnalysisofPrimaryandMetastaticTumorEcosystemsinHeadandNeckCancer

01Highlights

(1)单细胞RNA-seq显示不同的恶性细胞、基质和免疫细胞(2)恶性细胞在细胞周期、缺氧和上皮表达程序上各不相同(3)刚开始的部分EMT过程(p-EMT)是由微环境调节的

(4)计算模型改进了TCGA亚型，将p-EMT与转移联系起来

02SUMMARY

肿瘤中不同的恶性、基质和免疫细胞影响生长、转移和治疗反应。作者分析了18例头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者的个单细胞的转录组，包括5对配对的原发肿瘤和淋巴结转移。基质细胞和免疫细胞在患者间具有一致的表达程序。相反，恶性细胞在肿瘤内部和肿瘤之间表达与细胞周期、应激、缺氧、上皮分化和部分上皮-间充质转化(p-EMT)相关的信号。表达p-EMT程序的细胞空间定位于原发肿瘤的前缘。通过整合数百个肿瘤的单细胞转录组和整体表达谱，作者通过恶性和间质成分细化了HNSCC亚型，并建立了p-EMT作为淋巴结转移、肿瘤级别和不良病理特征的独立预测因子。作者的结果能够帮助研究者深入了解HNSCC生态系统、定义基质相互作用和与转移相关的p-EMT程序。

03INTRODUCTION

基因组和转录组研究揭示了主要人类肿瘤的驱动突变、异常调控程序和疾病亚型。然而，这些研究依赖于测量肿瘤体积的分析技术，限制了它们捕获肿瘤内异质性的能力。大量证据表明，恶性和非恶性细胞之间的瘤内异质性及其在肿瘤微环境(TME)中的相互作用对肿瘤生物学的不同方面至关重要。

单细胞基因组学的最新进展为探索细胞分辨率下的遗传和功能异质性提供了途径。对人类肿瘤、循环肿瘤细胞(CTCs)和源自患者的异种移植的单细胞RNA-seq(scRNA-seq)研究揭示了肿瘤成分、癌症干细胞和耐药性的新见解。然而，尽管scRNA-seq的研究在上皮肿瘤中占主导地位，但它们并没有深入研究上皮肿瘤的特征。在这些肿瘤中，转移到引流淋巴结(淋巴结转移)和其他器官(远处转移)是发病率和死亡率的主要原因。转移治疗通常基于原发肿瘤的分子和病理特征，这就提出了一个问题:它们是否具有相同的遗传、表观遗传学和弱点。然而，原发肿瘤和转移瘤的潜在不同组成阻碍了直接比较肿瘤的整体特征。单细胞表达谱研究原则上提供了一种令人信服的选择。

上皮-间充质转化(EMT)被认为是上皮肿瘤扩散的驱动因素。EMT是胚胎发育的基础，但可能被恶性上皮细胞利用以促进侵袭和传播。目前，已经在与转移性疾病相关的CTCs上检测到EMT标记。然而，由于大多数EMT研究都集中在实验室模型上，EMT在原发性人类肿瘤和转移中的范围和意义仍存在争议。此外，虽然间充质亚型已被确定为某些肿瘤中被识别，但尚不清楚它们是否出现于间充质癌细胞，或者，也不清楚它们是否反映了TME中非恶性间充质细胞类型。

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一种异质性上皮肿瘤，与接触酒精和烟草密切相关，患者经常出现在晚期淋巴结转移。在这里，作者研究原发性HNSCC肿瘤和匹配的LNs，以更好地了解肿瘤内异质性、侵袭和转移。

18名患者的个细胞的转录谱显示了区分不同恶性、基质和免疫细胞的表达程序。恶性细胞在细胞周期、应激、缺氧和上皮分化过程中的表达不同。一些细胞也表达了细胞外基质蛋白的部分EMT(p-EMT)程序，但缺乏经典的EMT转录因子(TFs)。p-EMT细胞定位于原发肿瘤的前缘，靠近癌相关成纤维细胞。作者利用对HNSCC生态系统的了解，重新评估来自癌症基因组图谱(TCGA)的大量RNA-seq数据。这揭示了HNSCC表达亚型的新见解，并确立了p-EMT程序作为不良临床特征(包括侵袭和转移)的独立预测因子。

04结果1.HNSCC原发肿瘤和转移的单细胞表达图谱

图1通过单细胞RNA-Seq表征HNSCC的肿瘤内表达异质性(A)显示了为scRNA-seq收集和处理口腔原发性HNSCC肿瘤新鲜活检样本和匹配的转移性LNs的工作流

程。(B)Heatmap显示了一个典型肿瘤(MEEI5)中单个细胞的大规模拷贝数变异(行)，根据每个染色体位置周

围个基因的平均表达情况推断(列)。(C)Heatmap显示个单细胞上皮标记基因的表达情况(柱状图)，根据这些基因的平均表达情况进行

排序。

(D)小提琴图显示基于CNVs归类为恶性或非恶性细胞的上皮评分(上皮标记基因的平均表达)的分布情况。

图S1根据CNVs和上皮标志物的表达将细胞分为恶性和非恶性(A)直方图显示细胞按读数排序的分布情况(左;中位值万)，转录组对应的读取的百分比(中位值;中位

数52.2%，以及检测到的独特基因数(右;检测到的基因中位值为3,个)。(B)Heatmap显示18个肿瘤中单个细胞的大规模拷贝数变异(行)，根据每个染色体位置周围个基因的

平均表达推断(列)。(C)根据全外显子组测序结果，对来自3名患者的7个样本(行)进行大规模拷贝数变异分析。

(D)27个样本的条形图显示恶性(蓝色)和非恶性(红色)细胞的百分比，按一种(浅色)或两种(深色)的独立方法进行分类:上皮标志物评分和CNVs。27组中有22组含有95%恶性或非恶性的细胞;其余五个样本中的细胞被排除在进一步的分析之外。

分析:

(1)为了探讨HNSCC肿瘤的细胞多样性，作者聚焦于口腔肿瘤，这是HNSCC最常见的部位。作者分析了18例初治患者的原发性肿瘤的全长scRNA-seq，并对其中5例患者的淋巴结转移进行了匹配分析(图1A)。

(2)作者还获得了这些肿瘤的全外显子组测序(WES)和靶向基因分型(SNaPshot)数据，这些数据显示了一系列假定的驱动突变和染色体畸变(图S1B)，与已建立的HNSCC基因一致。

(3)在初始质量控制后，作者保留了18例患者5,个细胞的单细胞转录组(图S1A)。作者通过三种互补的方法确定了2,个恶性细胞和3,个非恶性细胞。首先，作者根据染色体间隔的平均表达谱推断出每个单细胞的染色体拷贝数变异(CNVs)。这些推断的CNVs与WES一致(图1B、S1B、S1C)，将恶性细胞从正常核型的非恶性细胞中分离出来。

(4)其次，作者通过上皮来源区分恶性细胞。恶性细胞不同于TME中的基质细胞和免疫细胞(图1C)，上皮标志物表达的细胞和出现异常核型的细胞之间具有显著的一致性(图1D)。

(5)最后，作者根据细胞的整体表达模式将细胞初步分为不同亚组。根据CNV和上皮标志物分析，绝大多数细胞为恶性或非恶性分类一致的亚组(图S1D)。

2.头颈部肿瘤的基因表达异质性图谱

图S1根据CNVs和上皮标志物的表达将细胞分为恶性和非恶性(E)非恶性细胞的t-SNE图(如图2A所示)，由SC3将其分配到14个亚组中着色，使用默认参数，显示SC3亚

组与tSNE坐标高度一致。

(F)10个肿瘤的非恶性细胞的t-SNE图(同图2A)，根据特定细胞类型的标记基因组的平均表达染色。零表达水平用小圆圈表示，阳性表达用大圆圈表示，高表达用红色阴影表示。

图2恶性和非恶性细胞在HNSCC生态系统中的表达异质性(A)10例非恶性细胞的t-SNE图，肿瘤中基质细胞和免疫细胞呈一致的亚组状。根据不同表达的基因，集

群被分配到了指定的细胞类型(也见图S1F)。(B)(左)在T-SNE图中放大了具有明显的幼稚、调节、细胞毒性和耗尽群体的T细胞，经DBscan聚类鉴

定。

(右)将成纤维细胞与肌成纤维细胞、非活化的静息成纤维细胞和活化的CAFs的t-SNE图放大，可以看到它们进一步分成两个亚组。列出了关键亚群的差异表达基因。

(D)Heatmap显示10个原发性肿瘤中差异表达的基因。在五种肿瘤中，匹配的LNs也有表达。

红色:高表达;蓝色:低表达。选中的基因被突出显示。两种典型亚型肿瘤(MEEI6和MEEI20;与解毒和药物代谢相关的优先表达基因(如GPX2、GSTMs、CYPs、ABCC1)。

图S2基质细胞和免疫细胞在HNSCC生态系统中的表达异质性(A)(上部)放大T细胞的T-SNE图，发现了四个不同的亚组。(底部)差异表达基因的热图(行)有助于将四个亚组(列)标注为幼稚型、调节性、细胞毒性和耗尽型。

(B)柱状图显示了6个肿瘤中耗尽的CD8+T细胞的百分比。(C)(上部)放大成纤维细胞的t-SNE图，发现有两个不同的亚组和一组中间产物。

(底部)差异表达基因的热图有助于对亚组进行注释，因为肌成纤维细胞、活化的CAFs和中间(静止)成纤维细胞缺乏与肌成纤维细胞或CAFs一致的一致基因表达。

(D)PC1PC2和主成分分析的成纤维细胞,，以颜色不同显示的三个集群，进一步表明PC2CAF集群分为两个亚种群(CAF1CAF2)。

(E)CAF1和CAF2亚群差异表达基因(行)的热图。

(F)Heatmap显示10个肿瘤上调基因的相对CNVs分布(列)。

相对拷贝数(RelativeCNVs)计算为各自肿瘤的拷贝数(CNV)减去其他所有肿瘤的平均拷贝数(CNVs)。

(G)柱状图显示每个肿瘤中相对CNV为0.15的上调基因(蓝色)和其他基因(红色)的百分比，显示所有病例中高CNVs上调基因显著富集(Bonferroni校正超几何检验，p0.05)。

(H)恶性t-SNE图(左;与图2C相同)，非恶性(右;图2A)细胞被检测到的独特基因数量染色。这些图表明，聚类不是由检测到的基因数量驱动的。用批注释的集群的附加分析表明，集群不是由批效应决定的。

分析:

(1)非恶性细胞的单细胞分析显示了TME的组成。作者将3个非恶性细胞按其表达状态分为8个主要的亚组(图2A,S1E,S1F和S2H)。作者通过T细胞、B/浆细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肌细胞等已知标记基因的表达对亚组进行注释(图S1F)。值得注意的是，每个亚组包含来自不同患者的细胞，表明TME中的细胞类型和表达状态在HNSCC肿瘤中基本一致，不代表患者特异性亚群或批次效应，尽管它们的比例有所不同。

(2)通过更精细的聚类，作者在T细胞和成纤维细胞中进一步发现了其存在的多样性(图2B)。主要的T细胞群可以分为四个亚群(图2B和S2A)，作者将它们注释为调节性T细胞(Tgs)、常规CD4+T辅助细胞(CD4+Tconv)和两个细胞毒性CD8+T细胞群(CD8+T和CD8+Texhausted)。

细胞毒性亚群在共抑制受体(如PD1、CTLA4)和其他与T细胞功能障碍和衰竭相关的基因表达上存在差异，从而定义了HNSCC中假定的T细胞衰竭程序(图2B和S2A)。在作者的队列中，衰竭CD8+T细胞的比例在患者中存在显著差异(图S2B)。这些T细胞表达状态可能有助于理解和预测免疫检查点疗法的反应。

(3)目前，成纤维细胞在人类肿瘤中的调控作用并未被阐明。作者将个成纤维细胞分成两个主要亚群(图2B，黑色和蓝色)和第三个小亚群(图2B，S2C和S2D)。

第一个亚群表达肌成纤维细胞的经典标记，包括alpha平滑肌肌动蛋白(ACTA2)和肌球蛋白轻链蛋白(MYLK,MYL9)。肌成纤维细胞是TME的组成部分，与伤口愈合和挛缩有关。

第二个亚群表达受体、配体和细胞外基质(ECM)基因，包括成纤维细胞激活蛋白(FAP)、podoplanin(PDPN)和结缔组织生长因子(CTGF)，它们与CAFs相关。

第三个亚群缺乏肌成纤维细胞和CAFs的标记物，可能代表休眠的成纤维细胞。这些不同的成纤维细胞表达状态在肿瘤中可重复检测到，因此可能代表了HNSCCTME的共同特征。

(4)尽管CAFs的细胞特征和起源被归因于不同的谱系，但作者检测到的亚群与成纤维细胞特征高度一致。进一步的分析将CAFs划分为两种类型(CAF1和CAF2)，其差异表达某些基因如:即时早期反应基因(如JUN、FOS)、间充质标记(如VIM、THY1)、配体和受体(如FGF7、TGFBR2/3)和ECM蛋白(如MMP11、CAV1)(图S2D和S2E)。

(5)与非恶性细胞相比，2个恶性细胞根据其肿瘤来源被分组(图2C和S2H)。超过个基因在单个肿瘤中优先表达(图2D)。差异表达基因在不同肿瘤的CNVs中富集(图S2F和S2G)。

其他差异与肿瘤亚型有关。例如，与解毒和药物代谢相关的基因(如GPX2、GSTMs、CYPs、ABCC1)在作者的队列里被发现在两种经典亚型肿瘤中优先表达(MEEI6和MEEI20;图2D)。

其他表达差异的基因与应激(如JUNB、FOSL1)或免疫激活(如IDO1、STAT1、TNF)相关，可能与多种TMEs相关。

因此，肿瘤间恶性细胞表达的异质性反映了作者队列中肿瘤在遗传基因、亚型和TME方面的差异。3.恶性腔室肿瘤的表达异质性

图S2基质细胞和免疫细胞在HNSCC生态系统中的表达异质性(I)(上部)Heatmap显示了来自MEEI25的单个细胞中管家基因和免疫标记基因的绝对表达(同图3A)。(中部)Heatmap显示了在MEEI25的单细胞中，NNMF识别的定义不同元程序的基因的绝对表达。

(底部)柱状图显示MEEI25中单个细胞中检测到的基因数(柱状图)，细胞的排列顺序与顶部和中间的图一致。

检测到的基因数量的可变性与确定的表达程序无关。

图3无偏聚类显示了在HNSCC肿瘤中p-EMT的一个共同程序

(A)Heatmap显示了经非负矩阵因子分解(NNMF)鉴定的差异表达基因，这些基因通过其在一个典型肿瘤(MEEI25)的单细胞中的表达聚集在一起。基因亚组揭示了MEEI25中差异表达的肿瘤内程序。相应的基因特征被编号，选择的基因被标示出来(右)。

(B)Heatmap描述了来自10个肿瘤的60个肿瘤内程序的相关性。聚类确定了7个贯穿肿瘤的一致表达程序。热图中与MEEI25程序对应的行用箭头表示，编号如(A)所示。

图S3在HNSCC肿瘤和细胞系中定义p-EMT程序，见图3

(A)每个图(从上到下)显示恶性细胞中六个相关表达程序的meta特征分数(图顶部)和该meta特征的前10个基因表达的热图(图底部)。10个HNSCC肿瘤的细胞首先被纳入并按肿瘤分类(从左到右)，在一个肿瘤中按样本分类，在一个样本中按相应的meta特征评分分类(黑线)。

(B)每个图(从上到下)显示小提琴图，它描绘了(A)十个肿瘤的恶性细胞的六个meta特征中的一个的分数。

第二张图显示p-EMT评分，显示p-EMT低组(蓝色)和高组(红色)肿瘤。(C-F)线形图显示所选基因的平滑表达;纳入10个HNSCC肿瘤细胞，并根据p-EMT程序表达顺序排列。

选择的基因包括6个排名最前的p-EMT基因(C)、8个与p-EMT评分负相关的上皮基因(D)、6个与p-EMT评分不相关的上皮基因(E)和典型EMT转录因子(TFs)(F)。

分析:

(1)接下来，作者研究了同一肿瘤内不同恶性细胞的表达状态如何变化，重点研究了获得最多恶性细胞转录组的10个肿瘤。作者使用非负矩阵因子分解来发现恶性细胞亚群优先共同表达的相关基因集。例如，作者定义了6个在MEEI25恶性细胞中不同的基因标记(图3A和S2I)。

(2)将该方法应用于每一种肿瘤，定义了60个基因标记，这些标记在至少一种肿瘤的单个细胞中出现了一致地变化。接下来，作者使用层次聚类将这60个基因标记提取为meta特征，这些特征反映了在多个肿瘤中不同的共同表达程序(图3B、S3A和S3B)。不同肿瘤标记的高度一致性表明，它们反映了肿瘤内表达异质性的共同模式。

(3)在至少两种肿瘤中，恶性细胞亚群优先表达了七种表达程序。第一第二个程序(图3A和图3B中的亚组1和亚组2)反映了细胞周期的G1/S和G2/M期，并区分了每个肿瘤

的周期细胞(不同肿瘤细胞的14%-40%)(图S3A;表S7)。第三个程序(图3A和3B中的cluster6)由JUN、FOS和与细胞激活和应激反应有关的早期基因组成(图S3A;

表S7)。第四个程序显示了缺氧相关基因的富集，并发现在缺氧条件下培养的HNSCC细胞中缺氧相关基因的增加

(图3B、S3A和S5Q;表S7)。

第五第六个表达程序(图3A和3B中的亚组4和亚组5)主要由上皮基因组成，如EPCAM、细胞角蛋白(如KRT6、16、17、75)和kallikins(KLK5-11)(图S3A;表S7)。虽然所有的恶性细胞都表达上皮标志物，其中许多在恶性细胞中基本一致(图1C、1D和S3E)，但这些特殊上皮基因的表达在恶性细胞中是一致的(图S3D)，可能反映了上皮分化的程度。

第七个表达程序(图3A和3B中的cluster3)包含与ECM相关的基因，具有EMT的特征(图S3A;表S7)。这一程序在10个被检测肿瘤中的7个的细胞亚群中表现得很明显(图S3B)。

4.HNSCC中p-EMT的表达程序

图S3在HNSCC肿瘤和细胞系中定义p-EMT程序，见图3(C-F)线形图显示所选基因的平滑表达;纳入10个HNSCC肿瘤细胞，并根据p-EMT程序表达顺序排列。

选择的基因包括6个顶级的p-EMT基因(C)、8个与p-EMT评分负相关的上皮基因(D)、6个与p-EMT评分不相关的上皮基因(E)和典型EMT转录因子(TFs)(F)。

图S4区分HNSCC肿瘤中的p-EMT程序与之前描述的EMT程序并在体外建模p-EMT，相关图3

(A)相关图显示了EMT和p-EMT程序之间的皮尔森相关性。

先前描述的tcga-间质基因(Mes)、来自肿瘤(Tumor)和细胞系(Cultu)的EMT标记与CAFs的表达程序密切相关。这些都与本研究中描述的p-EMT表达程序(Orig.)相关性不大。对恶性肿瘤特异性p-EMT基因(Malig.)和去卷积化处理后识别的p-EMT基因(Decon.)的研究显示，p-EMT与TCGA-Mes和之前的EMT特征的相关性更有限，表明该程序不同于之前的EMT描述。

(B)散点图显示了三组TCGA肿瘤，(1)高TCGA-mes/中p-EMT，(2)高p-EMT，(3)低p-EMT评分。(C)Heatmap显示了TCGA-间质基因、CAF和p-EMT基因在(B)中的相对表达，底部显示了8个恶性肿瘤特

异性p-EMT基因(“Malig.”)。

(D)条形图显示了(C)中描述的每个基因集在CAFs、恶性细胞和队列中检测到的所有其他免疫细胞和基质细胞类型中的平均表达。p-EMT特征在恶性细胞中显示出高度特异性，而TCGA-mes特征与CAFs相关。

图3无偏聚类显示了在HNSCC肿瘤中p-EMT的一个共同程序(A)Heatmap显示了经非负矩阵因子分解(NNMF)鉴定的差异表达基因，这些基因通过其在一个典型肿瘤

(MEEI25)的单细胞中的表达聚集在一起。基因亚组揭示了MEEI25中差异表达的肿瘤内程序。(B)Heatmap描述了来自10个肿瘤的60个肿瘤内程序的相关性。聚类确定了7个贯穿肿瘤的一致表达程

序。热图中与MEEI25程序对应的行用箭头表示，编号如(A)所示。(C)Heatmap按肿瘤显示p-EMT程序中普遍存在的和肿瘤特异性基因的NNMF基因评分。分析:

(1)虽然EMT被广泛认为是耐药性、侵袭和转移的潜在驱动因素，但其在人体内上皮肿瘤中的模式和意义尚不清楚。因此，作者仔细研究了EMT的特征——ECM过程。除了基质金属蛋白酶、层蛋白和整合蛋白等ECM基因外，该过程还包括EMT标记vimentin(VIM)和整合蛋白a-5(ITGA5)(图3A-3C、S3A和S3C;表S7)。此外，在本项目中得分最高的基因之一是转化生长因子(TGF)-b诱导(TGFBI)，暗示了经典的EMT调节因子TGF-b(图S3C)。

(2)虽然该程序具有经典EMT的关键特征，但它缺乏其他特征。首先，虽然其特征伴有某些上皮基因表达减少，但上皮标志物的整体表达得到了稳定维持(图S3D和S3E)。

(3)其次，作者没有检测到经典EMTTFs、ZEB1/2、TWIST1/2和SNAIL1的表达。只有SNAIL2被检测到(在70%的HNSCC细胞中)，尽管其表达与跨肿瘤的过程相关，但它与同意肿瘤中的跨肿瘤细胞过程无关(图S3F)。

(4)最近的研究表明，SNAIL2比其他EMTTFs更早达到峰值。SNAIL2还参与了伤口愈合过程中的p-EMT反应。作者注意到，EMT越来越被认为是一个连续的、可变的过程。因此，作者认为，这里确定的体内程序反映了部分EMT样状态或“p-EMT”。一些额外的分析表明，该p-EMT程序不同于从细胞系和肿瘤模型以及从肿瘤图谱中获得的“间叶细胞”特征的完整EMT程序(图S4A-S4D)。

5.在体外的p-EMT细胞是动态的、有侵袭性的

图3无偏聚类显示了在HNSCC肿瘤中p-EMT的一个共同程序(D)通过p-EMT标记物TGFBI将SCC9HNSCC细胞分为p-EMThigh和p-EMTlow两组，并用基质侵袭实验

分析的代表性图像。(E)柱状图描述了(D)中分选和分析的p-EMThigh和p-EMTlow的SCC9细胞的相对侵袭性。(F)柱状图显示p-EMThigh和p-EMTlow的SCC9细胞在(D)中的相对增殖情况。(G)(左)荧光激活细胞分选图识别基于TGFBI表达分离的p-EMThigh和p-EMTlowSCC9细胞。

(右)柱状图显示了TGFBI表达在各个分离株(p-EMThigh、p-EMTlow和未分类组)细胞间的分布(x轴)。培养7天后，p-EMThigh、p-EMTlow和未分选细胞的p-EMT标记物表达分布相似。p-EMT标记CXADR的其他实验也显示了类似的结果。

(H)小提琴图描绘了未排序、p-EMThigh、p-EMTlow组的SCC9细胞按(G)分类培养的p-EMT分数。各自的分离株在很大程度上再现了p-EMT分数的初始分布。

图S3在HNSCC肿瘤和细胞系中定义p-EMT程序，见图3

(G)Heatmap描述了10个肿瘤和5个口腔HNSCC细胞系的恶性细胞整体表达谱的皮尔森相关性。

作者计算了至少一个肿瘤或细胞系中平均表达(Ea)在4以上的所有基因的相关性，并对所有样本的基因表达水平进行了中心分析。聚类分析表明细胞系之间比原发肿瘤样本更相似，也说明了不同亚型肿瘤样本之间的区别。

(H)热图显示了5个口腔HNSCC细胞系中单个细胞表达谱的两两相关性，按层次聚类顺序排列。

SCC9包括一个具有类似于p-EMT程序的表达谱的细胞亚群，而SCC25有一个具有类似于应激程序的表达谱的细胞亚群。在这些亚群体中优先表达的选择基因被突出显示，用于分类实验的标记(TGFBI,CXADR)用粗体显示。

图S4区分HNSCC肿瘤中的p-EMT程序与之前描述的EMT程序并在体外建模p-EMT，相关图3

(E)折线图显示20个窗口内循环中恶性细胞百分比，按p-EMT评分排序。

包括7个p-EMT高表达的肿瘤;在每个肿瘤中显示一个p值，对应于该肿瘤中30%p-EMT最低的细胞中循环细胞的富集。在三个p-EMT评分最高的肿瘤(MEEI16、MEEI17和MEEI25)中，循环细胞显著富集低表达p-EMT细胞。

(H)(左上)荧光激活细胞分选图识别基于TGFBI表达分离的p-EMThigh和p-EMTlowSCC9细胞。(右上)直方图(偏移)显示了在各个细胞株被排序分离后(p-EMThigh和p-EMTlow)TGFBI的表达。

(底部)直方图(偏移)显示了TGFBI在不同分离株(p-EMThigh和p-EMTlow;用虚线分隔)培养4小时，24小时，4天，7天后的表达情况。p-EMThigh和p-EMTlow组在分选后4小时和24小时仍保持明显差异。

分析:

(1)作者研究了p-EMT程序在5个HNSCC细胞系中的功能意义。个细胞的表达谱与人类肿瘤明显不同(图S3G)。然而，在一个口腔来源的细胞系SCC9中的一个细胞亚群部分再现了体内p-EMT程序(图S3H)。流式细胞术分离p-EMThigh细胞后，其侵袭性增强(图3D和3E)。与患者样本的scRNA-seq分析(图S4E)和之前的EMT研究相一致，细胞的增殖率下降(图3F)。

(2)先前的研究表明，EMT的早期可能是过渡性的或亚稳态的。因此，作者考虑p-EMT是否反映了上皮亚群中动态平衡的一种瞬态状态。为了验证这一点，作者从SCC9中分离p-EMThigh和p-EMTlow细胞，培养它们，并重新评估标记物的表达。分选后4小时和24小时，两个亚组出现了显著差异(图S4H)，但培养4天后无法区分，两种培养都再现了未分选的SCC9细胞中标记物表达的分布(图3G、3H和S4H)。这种体外程序的动态特性提出了体内p-EMT程序也可能代表一种瞬态状态的可能性。

6.p-EMT细胞定位在靠近CAFs的前缘

图4处于前缘的p-EMT细胞与CAFs进行交叉通讯

(A-C)有代表性的HNSCC肿瘤(MEEI5,MEEI16,MEEI17,MEEI25,MEEI28)的IHC染色图像，包括了p-EMT标记物(PDPN,LAMB3,LAMC2)、恶性细胞特异性标记物p63(A和B)、上皮程序标记物SPRR1B(C)。

(D)散点图显示了导致HNSCC肿瘤内异质性的p-EMT程序和其他表达程序之间的Pearson相关性(图3)。蓝色圆圈表示单个肿瘤内的相关性;黑色圆圈和误差线分别代表不同肿瘤的平均值和SEM。

图S5p-EMT程序定位于肿瘤前缘，与核心的上皮分化程序不同，见图4

(A-C)用恶性细胞特异性标记p63对代表性肿瘤(MEEI5,MEEI16,MEEI17,MEEI25,MEEI28)进行p-EMT标记物(LAMC2,MMP10,TGFBI)的免疫组化染色。肿瘤前缘与p63和p-EMT标记共染色。标记物p-EMT标记物ITGA5的附加染色进一步验证了p-EMT在前缘的定位(数据未显示)。

(D)对代表性肿瘤(MEEI17,MEEI28)进行免疫组化染色以检测多种p-EMT标记物(LAMC2,TGFBI)。图片显示p-EMT标记物在肿瘤前缘共定位。

(E-G)用恶性细胞特异性标记物p63免疫组化对代表性p-EMT低肿瘤(MEEI20,MEEI26)进行p-EMT标记物(PDPN,LAMB3,LAMC2)的染色。低p-EMT肿瘤的前缘p-EMT标记呈极低的染色阳性。标记物ITGA5的附加染色证实了p-EMT程序在这些肿瘤中的最小染色(数据未显示)。

(H和I)对有代表性的肿瘤(MEEI16,MEEI17)进行上皮分化标记物(SPRR1B,CLDN4)和恶性细胞特异性标记物p63的免疫组化染色。

(J和K)代表性肿瘤(MEEI17)p-EMT(LAMC2,PDPN)和上皮分化(CLDN4)的免疫组化染色。标记显示p-EMT和上皮分化的标记物分别在前缘和核心的不同空间定位。

分析:

(1)作者通过体内和体外功能实验表明，p-EMT程序是动态的、侵袭性的，并且可能对TME做出反应。这促使作者研究在HNSCC肿瘤中表达该程序的细胞的原位空间定位。作者使用免疫组织化学方法对p-EMT程序中最重要的基因(PDPN、LAMC2、LAMB3、MMP10、TGFBI和ITGA5)和HNSCC标记物p63进行了肿瘤染色(图4A、4B和S5A-S5D)。这些实验揭示了一群恶性细胞共同染色p-EMT标记，并定位到肿瘤的前缘，与周围的基质紧密结合。

(2)在每个scRNA-seq中缺乏p-EMT程序的肿瘤这些标记物未被染色(图S5E-S5G)。相反，上皮细胞分化标志物(SPRR1B,CLDN4)的染色阳性出现在了肿瘤核心的一组不同的细胞中(图4C和S5H-S5K)，与这些程序与在scRNA-seq数据中的负相关一致(图4D)。

图4处于前缘的p-EMT细胞与CAFs进行交叉对话

(E)条形图显示恶性HNSCC细胞和显示的细胞类型之间假定的受体-配体相互作用的数量。

根据受体和相应配体在scRNA-seq数据中的表达情况计算相互作用数。外向相互作用是指来自恶性细胞的配体与指定细胞类型上的受体相互作用的总和，传入的交互作用则相反。恶性肿瘤细胞表达受体的配体明显多于CAFs。

(F)Heatmap显示了体内和体外CAFs中表达的配体的表达。所有体内CAFs、在MEEI18中体内CAFs的和来源于MEEI18的体外CAFs均有相对表达。

(G)Heatmap显示了TGF-b3或TGF-b途径抑制剂处理SCC9细胞时调控基因的相对差异表达。

图片包含了相对于载体,TGF-b3处理后表达显著增高和TGF-b抑制后表达显著降低的基因。反映了每组9个样本的RNA-seq图谱中指示基因的相对表达，对应于不同的剂量或时间点。选择的基因被标记并与体内p-EMT程序重叠(字体加粗)。

(H)小提琴图描述了以(G)中方法处理的SCC9细胞中p-EMT基因表达评分的分布，并通过scRNA-seq进行分析。与对照相比，TGF-b3处理组p-EMT评分升高，TGF-b抑制组p-EMT评分下降。

(I)柱状图显示以(G)中方法处理后SCC9细胞的相对侵袭性变化。体外用CAF-TGF-b处理HNSCC细胞可引起p-EMT程序的连续性诱导并增加侵袭性，而抑制TGF-b则有相反的作用。体外用caff相关配体TGF-b处理HNSCC细胞可引起p-EMT程序的相干诱导并增加侵袭性，而抑制TGF-b则有相反的作用。

图S5p-EMT程序定位于肿瘤前缘，与核心的上皮分化程序不同(L)柱状图显示了所观察到的10种细胞类型与恶性细胞外向相互作用的数量的统计学意义。x轴上方的条

形图表示交互次数多于预期，而x轴下方的条形图表示交互次数少于预期。(M)利用恶性细胞特异性标记物p63对有代表性的肿瘤(MEEI16,MEEI18)进行p-EMT和CAFs(FAP)的免疫

组化染色。FAP染色在肿瘤的前缘和间质中均可见，突出显示活化的CAFs。

(N)柱状图描述了载体、TGFb或TGFb途径抑制剂处理的SCC9细胞的相对增殖情况。

(O)直方图显示了在模拟感染的SCC9细胞(左上)和SCC9TGFBICRISPR敲除细胞(其他图)中特定大小的插入或缺失威位点的测序读数百分比。每个靶向TGFBI的sgRNAs都产生了超过98.8%的插入或缺失位点的读数，这表明TGFBI被有效敲除。

(P)柱状图描述了载体或TGFb处理后模拟感染的SCC9细胞或SCC9TGFBICRISPR敲除细胞的相对侵袭性。

(Q)小提琴图显示在正常供氧或缺氧条件下生长的SCC9细胞的缺氧程序评分。缺氧状态与缺氧评分显著升高相关。

(R)小提琴图显示的是SCC9细胞在标准条件(对照)、低氧条件或与MEEI18来源的CAFs共培养后p-EMT评分。在这些条件下，p-EMT的表达没有显著变化。

分析:

(1)p-EMT表达的肿瘤前缘定位促使作者考虑与TME的相互作用，如配体-受体信号。根据一种细胞类型表达的配体和另一种细胞类型表达的相应受体，作者推测了相应的肿瘤-间质相互作用，同时也预测了从恶性细胞到各种TME细胞类型的“外向”信号(图4E)。

(2)当作者考虑到恶性细胞的“传入”信号时，作者发现CAFs表达的配体数量明显高于恶性细胞表达的受体(图4E和S5L)。这些配体，如TGFB3-TGFBR2、FGF7-FGFR2和CXCL12-CXCR7可能促进EMT的相互作用(图4F)。因此，当作者对肿瘤进行CAF标记(FAP,PDPN)染色时，作者发现在p-EMT的细胞前缘附近存在CAFs(图4C和S5M)。

(3)为了评估配体-受体相互作用的功能意义，作者用TGF-b处理SCC9细胞。培养4小时可诱导一个p-EMT样过程，而TGF-b抑制后p-EMT样过程被抑制(图4G和4H)。

(4)TGF-b处理也增加了侵袭性和减少了增殖，而抑制则有相反的效果(图4I和S5N)。此外，TGFBI(TGF-b的已知靶点)和p-EMT中排序靠前的基因过表达对侵袭性和增殖的影响相似(图S4F和S4G)。相反，TGFBI的基因失活使TGF-b的相应作用消失(图S5O和S5P)。

(5)虽然作者试图在共培养中检测原发肿瘤的CAFs，但是后续实验发现，培养后的成纤维细胞失去了典型的激活标记物和配体的表达(图4F)，并未能在共培养癌细胞中诱导p-EMT应答(图S5R)。

综上所述，这些数据表明CAFs和恶性细胞之间的旁分泌相互作用促进了在HNSCC肿瘤前缘的p-EMT过程，并在肿瘤侵袭中发挥潜在作用。

7.瘤内HNSCC异质性在脑区转移中再次出现

图S6p-EMT程序和肿瘤亚位点(原发灶和淋巴结)肿瘤相关成纤维细胞的差异性，与图5相关(A)比较全外显子组测序检测的三个个体肿瘤(MEEI26、MEEI20和MEEI25)原发和LN样本之间的点突

变。

在每个肿瘤中，作者检查了至少一个样本(原发性或LN)中发现的所有突变，并将其分配为三个值中的一个:“已检测到”(黑色)、“未检测到”(白色)或由于“低覆盖率”因此未定义(灰色)。单个突变的读数足以定义一个突变为”已检测到,“但零变异读数被定义为“未检测到”的情况只有在，检测零变异读数样本的概率低于0.05时。

突变按其在样本中的识别顺序排列，并被分为四类:在原发肿瘤和LN之间共享、特异于原发肿瘤、特异于LN和未定义。值得注意的是，MEEI26中包含了两个LN样本，分别对应于左(同侧)和右(对侧)LNs，记为LNL和LNR。

(B)多个患者原发性肿瘤和LN样本差异表达基因的热图。对于5名原发肿瘤和LN样本匹配的患者，作者分别分析出了显著差异表达的基因(以p0.和倍数变化2)。所有被显示的基因至少有2名患者出现上调(左)或下调(右)。

红色:调节;蓝色:表达下调。深色为差异表达，浅色为交界性差异表达(p0.05，倍数变化1.5)。

(C)小提琴图显示5个原发肿瘤恶性细胞的p-EMT评分和匹配的LN。

(D)散点图显示每个样本中个体恶性细胞p-EMT得分的平均值(x轴)和变异性(y轴);纳入5例原发肿瘤(黑色)和匹配的LNs(红色)，将匹配的样本用直线连接。p-EMT高的肿瘤p-EMT评分的平均值和变异性均较高。

(E)来源于原发肿瘤(黑)和LN(红色)样品的成纤维细胞，按照肌成纤维细胞组基因的相对表达CAFs的区别(x轴)和那些CAF1CAF2子集之间的区别(y轴)进行评分，图片显示LNCAFs是偏向CAF1子集的。

(F和G)用恶性细胞特异性标记物p63对典型淋巴结转移瘤(MEEI25,MEEI28)进行p-EMT特异性标记(PDPN,LAMB3)的免疫组化染色。

图5肿瘤内HNSCC异质性在淋巴结转移中再次出现(A)五个原发肿瘤(黑色)和它们匹配的LNs(红色)的恶性细胞的t-SNE图。恶性细胞是按肿瘤而不是按部位

聚集的。

(B)5个原发肿瘤(黑色)的非恶性细胞和它们匹配的LNs(红色)的t-SNE图。非恶性细胞在肿瘤中是一致的，但它们的表现和表达状态在不同的位点有所不同。

分析:

(1)为了进一步了解HNSCC转移的潜在决定因素，作者比较了淋巴结转移和原发肿瘤的不同。虽然WES和推断的CNVs揭示了原发肿瘤和匹配LN样本之间的一些遗传差异，但他们没有识别出任何一致的差异，这可能是由于研究的个体数量较少导致的(图S1B、S1C和S6A)。

(2)恶性细胞在LNs中的表达谱也与相应的原发肿瘤基本吻合(图5A)。配对的样本中有少量的基因出现了明显的差异表达，但在整个队列中并不一致(图S6B)。而p-EMT高表达亚群和低表达亚群在不同部位的原发性肿瘤和LNs中是一致的(图S6C和S6D)。这些发现进一步证实淋巴结转移所需的程序是动态的，因此在原发性肿瘤和LNs的比较中存在未被发现的可能。事实上，之前的研究也未能发现肿瘤和脑区转移之间的遗传或转录差异。

(3)作者观察到基质细胞和免疫细胞在LNs和匹配的原发肿瘤中的一致性表现，并且发现了一些特异性的不同。

虽然大多数亚组包含来自两个位点的细胞，但肌细胞仅在原发肿瘤中可见，而B细胞/浆细胞仅在LNs中可见(图5B)。成纤维细胞亚群的表达也有差异:LN成纤维细胞富集肌成纤维细胞和CAF1亚型，并优先表达某些受体和配体(如IL1R1、MMP11、SPARC)(图5B、S2E和S6E)。这些表达差异支持LN中信号环境的改变，但也提示了TME在区域转移时可以基本保持稳定。

(4)这些发现促使作者使用上述标记物检查LN的组织学标本。作者发现大部分完整的上皮结构或恶性细胞的“巢”(图S6F和S6G)，其外围有p-EMT标记，被CAFs和其他TME成分包围。这些观察结果与“集体迁移”模型一致，其中恶性和间质细胞集群转移至淋巴结，形成淋巴结转移。另外，单个细胞可在同一部位转移并形成转移物(“单细胞播散”)，这也因此概括了转移淋巴结内原发肿瘤的异质性。

8.表达数据的去卷积化细化了HNSCC亚型

图6通过对数百个肿瘤的表达谱进行去卷积化，修正了HNSCC亚型分组(A)十个肿瘤的恶性细胞的t-SNE图。每个细胞亚组对应一个不同的肿瘤。细胞根据它们匹配的TCGA表达

亚型着色。黑色表示没有匹配。每个肿瘤可以分为三种亚型:基底型、非典型性和典型。

(B)10个肿瘤非恶性细胞的t-SNE图。每一亚组细胞对应一种不同的细胞类型。细胞根据它们匹配的TCGA表达亚型着色。黑色表示没有匹配。成纤维细胞和肌细胞高表达间充质亚型的特征基因，这可能反映了具有高间质代表性的肿瘤特征。

(C)对于每个TCGA亚型，热图显示非恶性细胞类型基因特征的相对表达，用于估计细胞类型的丰度。肿瘤分类为间充质高表达的基因特异的CAFs和肌细胞，而非富含T和B细胞的典型肿瘤。

图S7p-EMT程序与上皮细胞分化负相关，并可能预测淋巴结转移，见图6和图7(A)苏木素-伊红(HE)染色切片显示间质肿瘤(左)和基底肿瘤(右)，显示出间质肿瘤的间质浸润明显多于

基底肿瘤。

(B)(左)条形图显示间充质肿瘤中基质浸润的百分比明显高于基础肿瘤。

(右)条形图显示了间叶组织和TCGA肿瘤基底亚型的HE间质评分的的肿瘤数目，从0(最低)到4(最高)。

(C和D)散点图显示了HE间质评分(不同点的颜色表示)与CAF和TCGA间质评分(C)之间存在相关性，但p-EMT评分(D)不存在相关性。

分析:

(1)接下来，作者考虑了从scRNA-seq数据中确定的恶性肿瘤和基质中的表达程序的普遍性和预后意义。最近的一项TCGA研究分析了数百例HNSCC肿瘤的表达谱，并将其分为四种亚型:基础型、间质型、经典型和非典型型。尽管TCGA图谱是从大量肿瘤标本中获得的，但作者推测，单个细胞成分的表达程序可能获得更多的认知，并进一步研究了这些数据中定义的分子亚型是否反映了恶性程序、恶性细胞组成或TME组成的差异。

(2)作者首先确定了10个HNSCC肿瘤的TCGA表达亚型。作者对每个肿瘤的恶性细胞的对应亚型表达特征进行评分。令人惊讶的是，每个肿瘤都清晰地映射到三种亚型中的一种:基底型(7个)、典型(2个)或非典型(1个)(图6A)。

没有恶性细胞映射到间充质亚型，尽管它是口腔肿瘤中第二常见的亚型。然而，当作者将分析扩展到基质细胞和免疫细胞时，作者发现了数百个CAFs、肌成纤维细胞和肌细胞映射到间充质细胞亚型(图6B)。这一发现提高了间充质TCGA亚型在大样本中反映高间质代表性的可能性，而不是一个明显的恶性细胞程序。事实上，对TCGA样本的分析证实，间充质亚型肿瘤高表达了CAFs和肌细胞特异性基因(图6C)。此外，作者检查了TCGA产生的HNSCC肿瘤的组织学切片，结果证实间质肿瘤比基底肿瘤富含了多达约2.7倍的成纤维细胞(图S7A-S7D)。

图6通过对数百个肿瘤的表达谱进行去卷积化，修正了HNSCC亚型(D)热图描述了TCGA表达配置文件之间的成对关联，这些关联按照亚型注释的顺序排列。该分析包括所

有基因，并恢复了所有四种亚型。

(E)从总体TCGA表达谱中减去非恶性细胞频率的影响，从而推断出恶性细胞特异性表达谱的线性回归示意图。

(F)热图描述了TCGA表达配置文件之间的成对关联，这些关联按照亚型注释的顺序排列。该分析基于(E)中推测的恶性细胞特异性表达谱。经典和非典型亚型被保留。基底型和间叶细胞亚型合并为单一亚型，作者称之为恶性基底型。

分析:

(1)为了进一步研究TME成分对TCGA分类的影响，作者设计了一种计算方法来从TCGA图谱中减去非恶性细胞的影响。作者将分析局限于恶性细胞表达的基因。由于大多数这些基因也在非恶性细胞中表达，作者对它们的表达进行标准化，以去除非恶性细胞可能的作用。为此，作者使用细胞类型特异的基因特征估计的肿瘤细胞类型的相对丰度，然后，作者推测在每个基因在肿瘤间的表达量和每个细胞类型相对丰度之间存在线性关系，并使用多元线性回归对此进行分析(图6E)。利用该回归模型的残差，作者消除了细胞类型频率的影响，包括恶性细胞频率。并推断每个TCGA肿瘤的恶性细胞特异性内在表达谱。

(2)值得注意的是，虽然TCGA数据的标准分析恢复了所有四种亚型(图6D)，但推测的恶性细胞特异性表达分析消除了间质亚型，而维持了其他三种亚型(图6F)。以前划分为间叶细胞的肿瘤被发现是以前描述的基底亚型(现在称为“恶性-基底”)的一部分。

(3)作者验证了TCGA间充质评分反映了主要由CAFs表达的基因，并且与恶性细胞特异性p-EMT程序无关(图S4B-S4D)。因此作者认为，HNSCC肿瘤可细化为三种恶性细胞亚型(恶性基底细胞、典型和非典型性)，而先前描述的间叶细胞亚型反映了具有大量间质成分的恶性基底细胞肿瘤。合并的恶性肿瘤-基础亚型非常普遍，它包括TCGA中70%以上的口腔肿瘤，这与作者队列中10个肿瘤中的7个的分类相一致。

9.p-EMT预测转移和不良病理特征

图7p-EMT预测淋巴结转移和不良病理特征(A)基于主成分分析(PCA)从所有恶性-基础TCGA肿瘤中推测出的恶性细胞特异性特征的PC1和PC2基因评

分(n=)。p-EMT基因(红色)和上皮分化基因(绿色)是恶性基底肿瘤变异的基础。

(B)基于PCA对所有典型和非典型TCGA肿瘤中推测出的恶性细胞特异性谱的PC1和PC2基因评分(n=)。p-EMT(红色)和上皮分化(绿色)基因与这些肿瘤的变异有微弱的相关性。

图S7p-EMT程序与上皮细胞分化负相关，并可能预测淋巴结转移，见图6和图7

(E)各亚型TCGA肿瘤p-EMT评分折线图。(F)散点图显示TCGA基底和间叶肿瘤的上皮分化和p-EMT的评分在该肿瘤亚群中呈显著负相关。(G)散点图显示TCGA典型和非典型肿瘤上皮分化和p-EMT的评分，在该亚群肿瘤中不存在显著相关性。

(L)散点图显示了基因与p-EMT(x轴)和上皮分化(y轴)程序的相关性，这是基于TCGA恶性-基底肿瘤的恶性细胞特异性剖面所推测的。p-EMT(红色)、上皮分化(绿色)和EMTTFs(黑色)基因被标注出来，p-EMT与SNAIL2存在高度相关性，但与其他EMTTFs无相关性。

分析:

(1)TCGA数据的合并使得作者有机会在更大的队列中检查p-EMT表达程序的普遍性和意义。在作者较小的队列中，p-EMT程序在10个肿瘤中的7个中明显存在(图S3B)，它们与7个映射到恶性基底亚型的肿瘤完全对应(图6A)。在TCGA中，p-EMT表达水平在恶性基底肿瘤中最高(图S7E)。此外，对恶性基底型TCGA肿瘤(非典型和典型肿瘤)的主成分分析显示，前两种成分与p-EMT基因表达相关，与上皮分化基因呈负相关(图7A、7B、S7F和S7G)。

(2)值得注意的是，从这些无偏倚表达数据分析中定义的p-EMT程序与作者的scRNA-seq分析中定义的程序高度一致(图7A)。独立证实了除了SNAIL2之外，经典的EMTTFs并不存在(图S7L)，进一步支持了人体肿瘤中的体内p-EMT状态。因此，通过控制TME组成的混杂效应，作者证明了p-EMT程序表达的差异是HNSCC肿瘤中肿瘤间变异的主要来源。

图S7p-EMT程序与上皮细胞分化负相关，并可能预测淋巴结转移，见图6和图7

(H)柱状图显示了TCGA恶性-基底肿瘤中6个相关元特征中的每一个特征与出现多重转移和无转移LNs之间的趋势和统计学意义。p-EMT和上皮分化程序在表达研究中呈负相关，而这与出现转移则相反。其他方案与淋巴结转移没有显著的相关性。

(I)(上)柱状图显示了p-EMT高评分或低评分组中出现不良临床特征(阳性LNs、多发LNs、晚期N期、III级、淋巴结外扩增、淋巴血管侵犯和晚期局部疾病)患者的百分比，p-EMT评分按高、低CAF评分分层。

(底部)Heatmap通过使用两个预测变量(p-EMT和CAF评分)和交互效应的二项logistic回归显示p-EMT和CAF对不良临床特征的影响具有统计学意义。只有p-EMT效应可以预测与转移和侵袭相关的临床特征(阳性LNs、多发LNs、淋巴结晚期、囊外扩张和淋巴血管侵犯)(下图，第一行)。相反，CAF效应对与转移相关的特征没有显著的预测价值，但可以预测高级别疾病和晚期局部疾病(T3/T4)(下图，第二行)。p-EMT和CAF效应确实会协同影响淋巴结转移的风险(下图，第三行)，这与CAFs和p-EMT细胞之间的配体受体相互作用的假设一致。

(J)TCGA患者中，使用不同的p-EMT评分阈值和按肿瘤(T)分期分层进行颈部清扫的比例。

合理的颈部清扫是指临床最初诊断为淋巴结阴性(cN0)，颈部清扫显示转移淋巴结阳性(pN1-N3)的患者;从所有临床淋巴结阴性的病人中计算出进行颈部剥离手术的合理颈部剥离百分比。无论t期如何，p-EMT阈值越高，颈部清扫率越高。

(K)在作者的10例患者队列中，肿瘤和肿瘤内的基因与p-EMT程序的相关性。分别计算每个肿瘤的肿瘤内相关性并取平均值;作者计算了每个肿瘤中所有恶性细胞的平均基因水平和p-EMT程序之间的跨肿瘤相关性。

(L)散点图显示了基因与p-EMT程序(x轴)和上皮分化程序(y轴)的相关性，这是基于TCGA恶性-基底肿瘤的恶性细胞特异性基因图谱推断的。p-EMT(红色)、上皮分化(绿色)和EMTTFs(黑色)基因被显示出来，这说明了p-EMT与SNAIL2存在高相关性，但与其他EMTTFs并无相关性。

图7p-EMT预测淋巴结转移和不良病理特征(C)柱状图显示了p-EMT高和p-EMT低的恶性-基底肿瘤与各临床特征相关的百分比。较高的p-EMT评分与LNs阳性、淋巴结晚期、高级别、结外扩展(ECE)和淋巴血管侵犯(LVI)相关。以T分期确定的晚期局部疾病(T3/T4)与p-EMT评分无关。(D)火山图显示了有多个LNs的TCGA恶性-基底肿瘤与无LNs阳性的肿瘤之间的基因表达差异。在转移性肿瘤中，p-EMT基因(红色)表达增加，而上皮分化基因(绿色)表达减少。

分析:

HNSCC肿瘤通过淋巴播散形成淋巴结转移是疾病负担和死亡率的主要原因。因此，口腔肿瘤切除术通常伴有颈部清扫，以去除引流LNs的第一梯队，这一过程与患者的发病率有关。有不良预后特征的肿瘤(如淋巴结外扩增或淋巴血管侵犯)也要接受辅助治疗。因此，作者测试了体内p-EMT的特征是否可以预测恶性-基底肿瘤的不良病理特征或疾病结局。

(1)作者发现p-EMT高评分与淋巴结转移的存在和数量以及淋巴结分期高相关(图7C)。作者还发现p-EMT高评分与较高的肿瘤级别有关，这为低分化肿瘤的侵袭性提供了解释。较高的p-EMT评分同样与不良病理特征相关，包括淋巴外扩增和淋巴血管侵犯(图7C)，不过这些都缺乏可靠的生物标记。有趣的是，p-EMT与原发肿瘤大小无关(图7C)，提示p-EMT与肿瘤的侵袭和转移直接相关，而与肿瘤的生长无关。

(2)总的来说，p-EMT基因是与这些临床特征最相关的基因之一，而其他项目如细胞周期或缺氧则没有那么紧密的相关(图7D和S7H)。相反，上皮细胞分化与转移呈负相关(图S7H)，这与作者之前观察到的p-EMT与上皮细胞分化呈负相关的结果一致。重要的是，p-EMT程序比TCGA间质程序或传统EMT特征能更好的预测淋巴结转移和肿瘤的局部侵袭(图S7I)，两者都主要反映CAF频率(图S4A和S7I)。

目前的临床实践依赖于不完善的淋巴结转移的预测因素，肿瘤的厚度和大小，都会导致高比率(80%)的不必要的颈部清扫。p-EMT评分可以帮助预测淋巴结转移，从而避免病人因不必要的颈部清扫而导致的发病率(图S7J)。

05讨论

(1)肿瘤内的异质性是肿瘤学领域的一个主要挑战。在新兴技术中，scRNA-seq有助于识别与肿瘤生物学、诊断和治疗相关的发育层次、耐药性项目和免疫浸润模式。在这里，作者应用该方法来解释原发性HNSCC肿瘤和匹配的淋巴结转移。作者的分析强调了一个复杂的细胞生态系统，恶性和非恶性细胞之间存在活跃的交叉对话，以及存在的一个与转移相关的体内p-EMT程序(图7E)。本研究能够进一步的了解上皮肿瘤内表达异质性。

恶性-基底HNSCC肿瘤侵袭和转移的体内p-EMT程序模型

(2)作者的主要发现之一是在体内恶性细胞中识别p-EMT程序。该程序包括上调某些间充质基因和调节上皮化过程。虽然让人联想到类似EMT的过程，但该项目缺乏经典的TFs来驱动EMT(除SNAIL2)。在作者的研究队列和TCGA肿瘤中，结果均显示SNAIL2水平与肿瘤个体细胞间的p-EMT程序无关，但与肿瘤间的p-EMT程序相关(图S7K和S7L)，这提示了转录后调控。之前的研究已经将SNAIL2与伤口愈合所需的EMT样改变联系起来，这增加了这种生理反应被侵袭性肿瘤细胞吸收的可能性。

(3)由于缺乏经典的监管程序、持续存在的上皮标记分子以及其表达仅持续短暂的状态，作者推测p-EMT过程可能反映了“亚稳”状态，它可以概括EMT的某些方面，但可能本质上不同于体外定义的EMT过程。

事实上，尽管作者描述的是一个孤立的类似EMT的过程，但随着越来越多的证据表明EMT存在连续状态，对EMT的分子描述正在被重新评估。也有假设认为，动态p-EMT状态在不丧失肿瘤启动能力的情况下具有侵袭性。目前尚不清楚在HNSCC中是否存在完整的EMT状态，或者是否仅扩展到p-EMT。无论如何，作者对患者体内p-EMT类程序的无偏倚定义能够在未来指导这一过程的研究，它与人类癌症和转移有关。

(4)一些观察表明，p-EMT程序可能促进局部浸润和淋巴结转移。

首先，免疫组化分析清楚地显示，该项目定位于原发肿瘤的前缘，可能使成群的细胞能够集体迁移(图7E)。有趣的是，p-EMT细胞与TME周围的CAFs非常接近，这与支持这些群体间调节性交叉的配体-受体分析相一致。

第二，p-EMThighHNSCC细胞在体外具有更大的侵袭潜力。第三，对数百例HNSCC肿瘤的大量表达谱进行去卷积化分析发现，p-EMT程序是患者之间变异的主要来

源，它对淋巴结转移、淋巴血管侵犯和结外扩散具有很强的预测作用。

更重要的是，尽管CAF丰度不能独立预测淋巴结转移和侵袭，但CAF评分高和p-EMT评分高的肿瘤具有特别高的转移倾向，这存在着一致的协同效应(图S7I)。可能反映了CAFs和恶性细胞之间的旁分泌信号通路在促进淋巴结疾病中的作用。

(5)局限性第一，作者研究队列只有10个肿瘤有深度特征，对更多肿瘤的分析可能揭示更多的间质、免疫和恶性细

胞状态，可能包括进一步发展为间质状态的恶性细胞。第二，p-EMT程序在典型和非典型的HNSCC肿瘤中很少，尽管转移率相似。因此，p-EMT可能与某些亚

型相关，但与其他亚型无关，这可能解释了EMT在肿瘤生物学中重要性的不一致。

第三，尽管作者的数据表明p-EMT状态对CAF信号有响应，但该程序可能仅仅是由于肿瘤边界中断导致的TME相互作用增加的功能，因此与转移相关，但不是转移的原因。需要进一步研究确定p-EMT和相应基质相互作用驱动HNSCC转移的精确机制。

(6)基大规模分析的亚型分类方案已被应用于多种肿瘤类型，但无法有效地分析肿瘤内部异质性。在这里，通过对恶性、基质和免疫细胞类型在HNSCC肿瘤中的表达状态的分析，使作者能够消除许多不需要的TCGA数据，并推断出恶性细胞特异性表达谱。这一分析表明，间充质亚型反映了TME，即肿瘤内CAFs和肌细胞的比例。

事实上，没有恶性细胞归属于TCGA中的间充质亚型。因此，间充质亚型可能反映基质成分，应在未来的研究中重新评估。相比之下，作者发现其他三种HNSCC亚型(经典型、非典型型、基础型)得到了强有力的支持。每一种肿瘤的恶性细胞都只对应于其中一种亚型。这些亚型在控制TME时也保持稳定。尽管如此，基质成分提供预后潜力(图S7I)表明，未来的分类系统可能最终需要将肿瘤中的恶性和非恶性成分结合起来。

(7)总之，作者的工作为HNSCC生物学提供了重要的见解，并提供了恶性、基质细胞和免疫细胞图谱，这些图谱被证明与其他上皮恶性肿瘤相关。作者从大量表达数据中推导除了恶性细胞特异性特征的计算方法，重新纠正了HNSCC的亚型，并提供了从许多其他癌症数据集提取信息的一般策略。最后，作者对p-EMT程序的定义有助于将大量EMT数据与人体肿瘤的体内生物学联系起来。虽然还需要进一步的研究，但p-EMT程序与不良临床特征的关联可能指导未来的诊断策略和治疗算法。

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